do-not-copy { -webkit-user-select:none; -khtml-user-select:none; -moz-user-select:none; -ms-user-select:none; user-select:none;

Sabtu, 20 Agustus 2016

ENZIM AMILASE SUMBER BACHILLUS LICHENIFORMIS



TUGAS INDIVIDU

 ENZIM AMILASE SUMBER BACHILLUS
LICHENIFORMIS



 








OLEH :

NAMA      : HERNAWATI
NIM           : 913.04.040
JURUSAN : AGROTEKNOLOGI







SEKOLAH TINGGI ILMU  PERTANIAN WUNA
( STIP WUNA )
2016


ENZIM AMILASE

Enzim adalah molekul biopolimer yang tersusun dari serangkaian asam amino dalam komposisi dan susunan rantai yang teratur dan tetap. Enzim memegang peranan penting dalam berbagai reaksi di dalam sel. Sebagai protein, enzim diproduksi dan digunakan oleh sel hidup untuk mengkatalisis reaksi, antara lain konversi energi dan metabolisme pertahanan sel. Amilase mempunyai kemampuan untuk memecah molekul-molekul pati dan glikogen Molekul pati yang merupakan polimer dari alfa-D-glikopiranosa akan dipecah oleh enzim pada ikatan alfa-1,4- dan alfa-l,6-glikosida.

Amilase merupakan enzim yang paling penting dan keberadaanya paling besar, pada bidang bioteknologi, enzim ini diperjual belikan sebanyak 25% dari total enzim yang lainya. Amilase didapatkan dari berbagai macam sumber, seperti tanaman, hewan dan mikroorganisme. Amilase yang berasal dari mikroorganisme banyak digunakan dalam industri, hal ini dikarenakan mikroorganisme periode pertumbuhanya pendek. Amilase pertama kali yang diproduksi adalah amilase yang berasal dari fungi pada tahun 1894.

Enzim alfa-amilase merupakan enzim yang banyak digunakan pada berbagai macam makanan, minuman dan industri tekstil. Alfa amilase ekstra seluler dihasilkan dari beberapa bakteri, diantaranya adalah Bacillus coagulans, B. stearothermophilus dan B. Licheniformis. Amilase adalah enzim yang paling penting dan signifikan dalam bidang bioteknologi, industri enzim amylase merupakan kelas industri yang memiliki kurang lebih 25% pasar enzim dunia. Enzim tersebut dapat diperoleh dari bermacam-macam sumber, seperti tumbuhan, binatang, dan mikroorganisme. Sekarang banyak mikrobia penghasil amylase yang tersedia secara komersial dan mikrobia tersebut hampir seluruhnya menggantikan hidrolisis kimia pati pada industri produksi pati.

Amilase yang dihasilkan mikroorganisme mempunyai spektrum yang luas pada aplikasi industri karena lebih stabil daripada-amilase yang dihasilkan oleh tumbuhan dan binatang. Keuntungan utama dalam penggunaan mikroorganisme pada produksi amilase adalah kapasitas produksi yang besar dan fakta bahwa mikrobia mudah dimanipulasi untuk menghasilkan enzim dengan karakteristik yang di inginkan.-amilase diperoleh dari bermacam-macam jamur, yeast dan bakteri. Meskipun demikian, enzim dari sumber jamur dan bakteri mendominasi aplikasi dalam sektor industri. amilase mempunyai kemampuan aplikasi yang luas dalam proses industry seperti makanan, fermentasi, tekstil, kertas, deterjen, dan industri farmasi. Amilase dari jamur dan bakteri dapat digunakan dalam industri farmasi dan kimia. Meskipun demikian, dengan perkembangan bioteknologi, aplikasi amilase berkembang di banyak bidang, seperti kesehatan, obat-obatan, dan analisis kimia, seperti aplikasi dalam sakarifikasi pati pada tekstil, makanan, brewing, dan industri distilasi.

Biokimia Enzim Amilase

Amylase Pencernaan makanan secara kimiawi terjadi dengan bantuan zat kimia tertentu. Enzim pencernaan merupakan zat kimia yang berfungsi memecahkan molekul bahan makanan yang kompleks dan besar menjadi molekul yang lebih sederhana dan kecil. Molekul yang sederhana ini memungkinkan darah dan cairan getah bening (limfe) mengangkut ke seluruh sel yang membutuhkan.

Macam-macam Enzim Amilase

Secara umum, amilase dibedakan menjadi tiga berdasarkan hasil pemecahan dan letak ikatan yang dipecah, yaitu alfa-amilase, beta-amilase, dan glukoamilase. Enzim alfa-amilase merupakan endoenzim yang memotong ikatan alfa-1,4 amilosa dan amilopektin dengan cepat pada larutan pati kental yang telah mengalami gelatinisasi. Proses ini juga dikenal dengan nama proses likuifikasi pati. Produk akhir yang dihasilkan dari aktivitasnya adalah dekstrin beserta sejumlah kecil glukosa dan maltosa. Alfa-amilase akan menghidrolisis ikatan alfa-1-4 glikosida pada polisakarida dengan hasil degradasi secara acak di bagian tengah atau bagian dalam molekul. Enzim beta-amilase atau disebut juga alfa-l,4-glukanmaltohidrolas E.C. 3.2.1.2. bekerja pada ikatan alfa-1,4-glikosida dengan menginversi konfigurasi posisi atom C(l) atau C nomor 1 molekul glukosa dari alfa menjadi beta. Enzim ini memutus ikatan amilosa maupun amilopektin dari luar molekul dan menghasilkan unit-unit maltosa dari ujung nonpe-reduksi pada rantai polisakarida. Bila tiba pada ikatan alfa-1,6 glikosida aktivitas enzim ini akan berhenti. Glukoamilase dikenal dengan nama lain alfa-1,4- glukan glukohidro-lase atau EC 3.2.1.3. Enzim ini menghidrolisis ikatan glukosida alfa-1,4, tetapi hasilnya beta-glukosa yang mempunyai konfigurasi berlawanan dengan hasil hidrolisis oleh enzim a-amilase. Selain itu, enzim ini dapat pula menghidrolisis ikatan glikosida alfa-1,6 dan alfa-1,3 tetapi dengan laju yang lebih lambat dibandingkan dengan hidrolisis ikatan glikosida a-1,4.

Sifat dan Fungsi Enzim Amilase

Enzim amylase yang berfungsi untuk mengubah karbohidrat menjadi gula sederhana. Enzim amylase juga berfungsi untuk mengubah tepung menjadi gula. Secara umum enzim memiliki sifat :
  • Bekerja pada substrat tertentu.
  • Memerlukan suhu tertentu.
  • Keasaman (pH) tertentu pula.

Suatu enzim tidak dapat bekerja pada substrat lain. Molekul enzim juga akan rusak oleh suhu yang terlalu rendah atau terlalu tinggi. Demikian pula enzim yang bekerja pada keadaan asam tidak akan bekerja pada suasana basa dan sebaliknya. pada suhu tinggi aktivitasnya tinggi tetapi kemantapan enzyme rendah. Suhu yang yang membuat aktivitas dan kemantaban suatu enzyme tinggi maka disebut suhu optimum.Jumlah hasil reaksi juga akan mempengaruhi aktivitas enzim.

Telah disebutkan beberapa factor yang mempengaruhi aktivitas enzim salah satunya suhu dan pH. Sehubungan dengan pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim, maka semakin meningkat suhu, aktivitas enzim akan semakin meningkat. Pada pemanasan tinggi enzim yang merupakan suatu protein akan mengalami denaturasi protein sehingga aktivitas kerjanya menjadi nol. Pada umumnya reaksi kima dengan naiknya suhu 10 derajat Celcius maka akan meningkatkan kecepatan reaksi sebesar 2 kali. Hal ini akan berlaku pada enzyme dengan suhu maksimum hingga 35 derajat Celcius. Jika lebih dari suhu tersebut enzim akan mengalami denaturasi sehingga merusak fungsi katalisatonya. Umumnya enzim mulai kehilangan sifat katalisatornya pada suhu 35 derajat Celcius dan berakhir pada suhu 60 derajat Celcius.

Oleh sebab itu perlu diketahui nilai suhu dan pH optimum dari enzim amylase yang ada pada air liur. Agar diketahui seberapa besar efek hidrolisis maka diperlukan blanko sebagai pembanding. Blanko ini berisi seperti tabung pengujian yang membedakan hanyalah penambahan air liur. Amilum akan membentuk kompleks dengan Iodium hingga menghasilkan larutan berwarna biru. Warna ini dapat di pakai dalam pengukuran absorbansi yang sebanding dengan kosentrasi amilum. Semakin besar nilai absorbsinya maka semakin besar kosentrasi amilum yang belum terhidrolisis.Untuk mengetahui besarnya hasil hidrolisis maka nilai A uji dikurangi dengan nilai A blanko sehingga di peroleh A yang artinya semakin besar nilai A maka semakin besar pula amilum yang telah terhidrolisis.

Sehingga jika di buatkan sebuah kurva hubungan antara suhu dan pH ,akan diperoleh nilai pH dan suhu optimum yang dipakai oleh enzyme. Enzim amilase adalah salah satu enzim yang mampu dihasilkan oleh jamur dan jamur yang menghasilkan enzim tersebut biasanya disebut jamur amilolitik. Dari beberapa penelitian yang telah dilakukan, jamur yang mampu menghasilkan enzim amilase berasal dari genus Penicillium, Cephalosporium, Mucor, Neurospora, Aspergillus dan Rhizopus.
Substrat dan Kondisi Untuk Sintesis Enzim Amilase

Sejumlah sumber karbon yang diuji dan ditelitinya, maltosa merupakan substrat yang terbaik untuk produksi protein dan amilase. Umumnya tepung gandum dan tepung jagung juga merupakan sumber karbon yang bagus untuk amilase rizhobia.

Produksi amilase, penambahan kalsium (10 mM) atau pepton 1% pada ekstrak yeast pada mediun mineral, akan memperpendek periode lag dan menambah pertumbuhan dan sintesis amilase. Penambahan glukosa pada kultur mengurangi dari sintesis a-amilase, hal ini bisa disebabkan karena glukosa mempengaruhi kegiatan bakteri ini. Suhu optimum pada sintesis amilase adalah sekitar 500 C dan pH optimum untuk sintesis amilase sekitar 7,0. Ekstrak enzim dipertahankan aktivitasnya 100% ketika diinkubasi selama 1 jam pada suhu 900 C dan 40% pada suhu 600 C selama 24 jam.

Komposisi dan konsentrasi media sangat mempengaruhi produksi dari enzim amilase ekstraseluler pada bakteri, yeast, dan Aspergillus sp. Komposisi medium sangat mempengaruhi produksi amilase, seperti halnya sporulasi pada Bacillus cereus. Keberadaan pati akan menginduksi produksi amilase. Keadaan lingkungan dan sumber nitrogen pada media kultur juga akan mempengaruhi pertumbuhan produksi amilase. Disamping karbon dan nitrogen, sodium dan garam potassium, ion metal, dan detergen juga akan mempengaruhi produksi amilase dan pertumbuhan mikroorganisme.

Manfaat Enzim Amylase

Enzim amylase banyak digunakan sebagai industri gula cair, makanan, industri tekstil, dan industri farmasi .Enzim ini juga banyak digunakan pada industri minuman misalnya pembuatan High Fructose Syrup (HFS) maupun pada industri tekstil, sebagai food additive untuk memperbaiki tekstur bahan makanan.Penambahan enzim alfa-amilase dalam bentuk tepung malt atau tepung enzim hasil kerja mikroorganisme dapat meningkatkan kemampuan menghidrolisa pati yang dikandung dalam tepung terigu, dengan demikian khamir yang tumbuh pada pembuatan adonan mendapat energi yang cukup sehingga pembentukan karbon dioksida optimal dan pengembangan adonan menjadi optimal amilase untuk produksi energi alternatif bioetanol, membantu metabolism karbohidrat.




Cara Menghasilkan Enzim Amylase

Degradasi yang terjadi pada pati diketahui dengan hilangnya material yang terwarnai oleh iodine. Uji deteksi α amylase yang menghidrolisis α-1,4-glikogen dan poliglucosan lainnya. Pada saat awal perlakuan terjadi penurunan yang cepat berat molekul pati yang dihasilkan dari pewarnaan iodine. Produk akhir utama dari degradasi ini adalah oligosakarida dengan berat molekul yang rendah. Sebaliknya, β-amilase mampu mengkatalisis sebuah serangan exolitik dan mendegradasi pati dengan cara memecah maltose dari ujung rantai pati. Enzim amylase dari B. subtilis dapat dipisahkan satu sama lain dan secara subsekuen mengeluarkannya bersama maltose. Enzim amylase dapat dipisahkan dari protease dengan menambahkan insoluble starch ke dalam kultur untuk menyerap amilase.

Aktivitas amilase dilakukan oleh enzim bakteri dan terlihat berwarna biru di dalam iodin. Apabila iodin menyebabkan media pati berwarna biru pada koloni bakteri maka tidak ada amilase yang diproduksi. Molekul maltosa yang kecil dapat masuk ke dalam sel untuk digunakan sebagai energi. Interaksi iodin dengan pati membuat media berwarna biru gelap. Produksi enzim amilase oleh koloni bakteri pada media ditunjukkan adanya zona bening dengan penambahan larutan iodin di sekitar koloni bakteri.
A. Bacillus sp.
Bacillus sp merupakan bakteri berbentuk batang, tergolong bakteri gram positif, motil, menghasilkan spora yang biasanya resisten pada panas, bersifat aerob (beberapa spesies bersifat anaerob fakultatif), katalase positif, dan oksidasi bervariasi.  Tiap spesies berbeda dalam penggunaan gula, sebagian melakukan fermentasi dan sebagian tidak (Barrow, 1993). Ditambahkan  Claus & Barkeley (1986) genus Bacillus mempunyai sifat fisiologis yang menarik karena tiap-tiap jenis mempunyai kemampuan yang berbeda-beda, diantaranya : (1) mampu mengdegradasi senyawa organik seperti protein, pati, selulosa, hidrokarbon dan agar, (2) mampu menghasilkan antibiotik; (3) berperan dalam nitrifikasi dan dentrifikasi; (4) pengikat nitrogen; (7) bersifat khemolitotrof, aerob atau fakutatif anaerob, asidofilik, psikoprifilik, atau thermofilik.
Menurut Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8 th editions dalam

Hadioetomo (1985) kalsifikasi Bacillus spp.  adalah sebagai berikut: Kingdom        : Procaryotae
Divisi              : Bacteria
Kelas              : Schizomycetes

Bangsa            : Eubacteriales
Suku               : Bacillaceae

Marga             : Bacillus

Jenis               : Bacillus spp.


Gambar 1. Bacillus spp.

B. Bakteri amilolitik
Bakteri amilolitik merupakan bakteri yang memproduksi enzim amilase ( Frazier
& Westhoff, 1988).  Fungsi dari enzim amilase ini yaitu menghidrolisis pati yang dapat dihasilkan oleh bakteri, fungi, tumbuhan dan hewan.  Amilase yang dihasilkan oleh bakteri amilolitik ini banyak dimanfaatkan dalam industri kelompok bakteri amilolitik yang cukup dikenal luas antara lain Bacillus, Clostridium, Bacteriodes, Micrococcus, Thermus, dan Actinomycetes (Reddy et al.2003). Naiola (2008) berhasil menemukan 8 isolat mikroba amilolitik pada
Nira dan Laru dari pulau Timor, Nusa Tenggara Timur yang diidentifikasi sebagai Bacillus licheniformis, Chromobacterium sp, Lactobacillus, Micrococcus roseus, dan Bacillus coagulans.  (Haq et al., 2005) menemukan  Bacillus licheniformis,


Syu & Chen, (1997) berhasil menenukan Bacillus amyloliquefaciens yang juga mampu mendegradasi amilum.
C.   Enzim Amilase
Enzim merupakan katalis seluler, hal itulah yang membuat reaksi biokimia dapat berlanjut berkali-kali lebih cepat.  Selain mampu meningkatkan reaksi, enzim memiliki dua sifat lain sebagai katalis sejati.  Pertama, enzim tidak diubah oleh reaksi yang dikatalisnya.  Kedua, walaupun mempercepat reaksi, enzim tidak mengubah kedudukan normal dari kesetimbangan kimia.  Dengan kata lain, enzim dapat membantu mempercepat pembentukan produk, tetapi akhirnya jumlah produk tetap sama dengan produk yang diperoleh tanpa enzim (Madigan et al.,
1997).
Aktivitas enzim di pengaruhi oleh beberapa faktor antara lain :
a.    Konsentrasi substrat
Aktivitas enzim berbanding lurus dengan konsentrasi substrat.  Kecepatan reaksi akan meningkat apabila konsentrasi substrat meningkat, peningkatan kecepatan reaksi ini akan semakin kecil hingga tercapai pada suatu titik batas yang pada akhirnya penambahan konsentrasi substrat hanya akan sedikit meningkatkan kecepatan (Lehninger, 1998).
b.    Pengaruh pH
Aktivitas enzim sangat bergantung pada pH dimana ia berada.  Setiap enzim mempunyai pH optimum yang berarti konsentrasi tertentu dimana reaksi enzim berada dalam keadaan maksimal.  pH optimal untuk beberapa enzim
pada umumnya terletak diantara netral atau asam lemah yaitu 4,5 – 8 (Tranggono dan Sutardi, 1990).
c.    Temperatur
Suhu berpengaruh dalam mempercepat reaksi.  Reaksi katalis enzim umumnya hanya berlaku sampai 60OC.  Enzim akan nonaktif jika berada di atas suhu ini.  Minimumnya enzim menjadi lambat dan terhenti pada 70 OC-
80 OC.
d.    Konsentrasi enzim
Penambahan konsentrasi enzim akan meningkatkan kecepatan reaksi bila substrat tersedia secara berlebih.  Dalam reaksi enzim, kecepatan reaksi sebanding dengan konsentrasi enzim.  Semakin tinggi konsentrasi enzim maka kecepatan reaksi akan semakin tinggi (Martin, 1983).


e.    Inhibitor

Inhibitor merupakan senyawa atau ion yang dapat menghambat aktivitas enzim (Lehninger, 1998).
Amilase adalah enzim yang memiliki kemampuan untuk memutuskan ikatan glikosida yang terdapat pada molekul amilum.  Pemecahan molekul amilum ini adalah molekul-molekul yang lebih kecil seperti maltosa, dekstrin dan terutama molekul glukosa sebagai unit terkecil ( Reddy et al., 2003). Menurut Chung, et al.,(1997) Enzim amilase merupakan salah satu enzim yang paling banyak diproduksi dan digunakan.  Amilase merupakan enzim yang menghidrolisa molekul pati untuk menghasilkan produk bervariasi.
Ditambahkan oleh Whittaker (1994) Amilase merupakan enzim yang bekerja menghidrolisis pati yang dapat dihasilkan oleh bakteri, fungi, tumbuhan dan
hewan.  Amilase yang dihasilkan oleh bakteri banyak dimanfaatkan dalam industri, terutama industri makanan, minuman, tekstil, farmasi, dan detergen.  Hal ini karena umumnya amilase asal bakteri mempunyai aktivitas yang tinggi dan bersifat lebih stabil dibandingkan yang berasal dari tumbuhan dan hewan. Sebagian besar industri, seperti industri makanan dan minuman menggunakan amilase tahan asam.  Pemanfaatan enzim dalam bidang industri harus
memperhatikan faktor penting yang sangat mempengaruhi efisiensi dan efektivitas dari enzim yang digunakan.  Amilase merupakan enzim yang paling penting
dalam bidang bioteknologi.

Menurut Poejiadi (1994) amilase dapat dikelompokkan menjadi 3 golongan enzim yaitu :
1. α-amilase


 
Enzim α-amilase termasuk dalam jenis enzim hidrolase karena memerlukan air dalam memecah ikatan spesifik α-1,4-glikosidik. Beberapa faktor yang dapat mempengaruhi aktivitas enzim adalah konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, pH, suhu, kofaktor enzim, dan inhibitor (Whitaker 1994). Enzim α-amilase (α-1,4 glukan-4-glukan hidrolase) terdapat pada tanaman, jaringan mamalia, dan mikroba. α- amilase murni dapat diperoleh dari berbagai sumber, misalnya dari malt (barley), ludah manusia, pankreas serta dapat juga diisolasi dari Aspergillus oryzae dan Bacillus subtilis (Winarno, 1986).


2. Beta amilase (β-amilase)

β-amilase (β-1,4 glukan maltohidrolase) terdapat pada berbagai hasil tanaman, tetapi tidak terdapat pada mamalia, dan mikroba.  Secara murni telah dapat diisolasi dari kecambah barley, ubi jalar, dan kacang kedelai. Enzim β- amilase memecah ikatan glukosida β-1,4 pada pati dan
glikogen dengan membalik konfigurasi karbon anomeri glukosa dari α menjadi β.  Enzim β-amilase aktif pada pH 5,0-6,0 (Winarno, 1986).

 
β-amilase tidak dihasilkan pada jaringan hewan, kecuali jika mikroorganisme terdapat dalam saluran pencernaannya.  Beberapa mikroorganisme yang mampu menghasilkan enzim β-amilase yaitu B. polymyxa, B. cerens, B. megaterium, Streptomyces sp, Pseudomonas sp, dan R. japanicus ( Cruger & Anneliese, 1984 )






3. Gamma amilase (γ-amilase)

Glukan 1,4-glukosidase, 1,4-D-glukan glukohidrolase, exo-1,4- glukosidase, glukoamilase, lisosomal α-glukosidase adalah nama lain dari Gamma amilase.  Pemutusan ikatan akhir α (1-4) glikosida pada

 
ujung non reduksi dari amilosa dan amilopektin, untuk menghasilkan unit glukosa, γ-amilase sangat efisien pada lingkungan yang bersifat asam dan bekerja pada pH optimum 3.


D.   Penentuan Karakter Bakter

Koloni bakteri dibentuk oleh sel tunggal suatu jenis bakteri yang terus mengalami pertumbuhan.  Setiap koloni bakteri dibedakan dari ukuran, tepi, warna permukaan, elevasi serta variasi lainnya ( Utomo, 1983).
Berdasarkan pengecatan Gram, terdapat dua kelompok bakteri yaitu bersifat gram positif dan gran gram negatif.  Pengelompokkan ini di dasarkan pada perbedaan peptidoglikan yang terdapat antara bakteri yang bersifat negatif dan positif ( Lay
& Hastowo, 1994).  Bakteri juga dapat dibedakan berdasarkan sifat morfologi selnya yang terdiri dari basilia, sprilia, koksi, pembentuk spora dan pleomorfik. Kemampuan fisiologis meliputi kemampuan meghidrolisis amilum, kasein, motilitas, katalase dan lainnya.  Selain itu, terdapat perbedaan antara lain sumber energi, cara pemanfaatan nitrogen, cara pemanfaatan karbohidrat, dan pemanfaatan oksigen (Sardjono, 2002).  Ditambahkan Lay ( 1994) ciri lain yang dapat membantu dalam karakterisasi mikroba adalah pola pertumbuhan, kemampuan memfermentasi karbohidrat dan penggunaan asam amino.



E.   Limbah Cair Nanas



Limbah cair bersumber dari kegiatan industri seperti halnya pembersihan, proses pemisahan, dan prduk konsentrasi nanas.  Tingginya rerata kandungan dari bahan organik (BOD, Biological Oxgen Demand) yang terdapat pada limbah nanas yaitu
338 mg/l, menjadikan suatu masalah dalam industri nanas.  Setiap harinya, volume limbah yang dihasilkan berkisar 5.000-7.000 m3.  Limbah cair ini banyak mengandung kurang lebih 87 % air, karbohidrat 10,54 %,  serat 1,7 %, serat kasar




20,87 % protein 0,7 %, abu 0,5 %, dan lemak 0,02 %, (Atmodjo dalam biota journal, hal 131).  Berdasarkan kandungan senyawa organik, limbah nanas ini tinggi akan karbohidrat dan gula, yang sering dimanfaatkan sebagai substrat untuk pertumbuhan bakteri nata synthesizer.  Sebelum di buang ke lingkungan sekitar, limbah ini di beri pengolahan khusus, seperti halnya di tampung terlebih dahulu pada kolam IPAL selama 2-3 bulan.  Beberapa teknik pengolahan limbah yang telah dikembangkan salah satunya pengolahan secara biologi.  Karakteristik biologi digunakan untuk mengukur kualitas air terutama air yang dikonsumsi sebagai air minum dan air bersih.



Bakteri  dari Genus Bacillus  memainkan peranan    utama    dalam    perkembangan     industri. Karena   mempunyai    sifat  yang  mudah   dipelihara dan  dikembangbiakkan    juga  mempunyai   karakter yang beraneka ragam yaitu psikrofilik, mesofilik, termofilik   di  samping   itu  alkalofilik,   neutrofilik dan  asidofilik.   Bacillus   licheniformis   menghasil- kan beberapa  enzim  ekstraseluler  yaitu  (J,-   amilase, amino   peptidase,    protease    metal,    ~-laktamase, endo- N -asetilglukoaminidase    dan lipase.'
Tujuan dari penelitian  ini adalah untuk mengetahui   kemampuan   bakteri   B.  licheniformis yang   dapat   menghasilkan    enzim   protease   yang bersifat  alkalin  dan termofilik.


Bahan  dan Cara Kerja
Bahan
a.   Isolat  sampel
B.  licheniformis   ditumbuhkan   di dalam  media
NutrientAgar    (NA) miring. b.  Media  seleksi  enzim
1% susu skim, 0,1 % pepton,  2% agar. c.  Media kultur  bakteri
1%  susu  skim,   0,1%  pepton   di  dalam   bufer
glisin-NaOH   pH 8,0 d. Uji aktivitas
0,1%  azokasein   dalam   larutan   buffer   glycin- NaOH  0,05 M pH 8, 10% asam  trikhloroasetat (TCA)
e.  Karakterisasi   pH
Substrat   azokasein   dengan  variasi  konsentrasi bufer  glisin-NaOH   0,05 M pH 7,5;  8; 8,5; 9,0;
10,0; 11,0.


Cara Kerja
a.  Isolat  sampel
B. Licheniformis   di dalam media NA diinkubasi pada  suhu kamar  sampai  berumur  3 hari.
b.  Media  seleksi
Media  seleksi  dituangkan  ke dalam  cawan petri steril.  Setelah  dingin  satu ujung  ose
B.  licheniformis    ditumbuhkan    dan  diinkubasi pada  suhu 37°C  selama  2 hari.
c.  Produksi  inokulum.
Satu  ujung   ose  B.  licheniformis    dimasukkan ke    dalam    tabung    reaksi    berisi    air    steril,

dikocok    dengan    vorteks.     Suspensi    bakteri diukur kerapatan optiknya (OD) dengan spektrofotometer   pada A 600 nm sampai OD mencapai  0,5.
d.  Media  produksi  enzim
Produksi protease dilakukan dengan menginokulasikan     2,5 mL inokulum  ke dalam
25 mL media  kultur   dan diinkubasi  pada  suhu
37°C selama  1-6 hari di atas pengocok  (shaker) inkubator   dengan   kecepatan    120  rpm.   Setiap hari  dilakukan   pengambilan    sampel  sebanyak
3  mL  dan  dipisahkan   filtrat  dan  endapannya dengan  cara    disentrifugasi    dengan  kecepatan
10.160  x g  selama  5 menit.  Filtrat  digunakan
sebagai larutan enzim dan diuji aktivitas proteasenya.  5


Uji Aktivitas  Protease
a. Uji Kadar Asam Amino

Sebanyak  0,2 mL larutan  enzim  direaksikan dengan   0,2  mL  substrat   0,1%   azokasein   dalam larutan  buffer  glycin-NaOH   0,05 M dengan  pH  8 dan  diinHkuUbasi   pada  suhu  40°C  selama  20 menit. Reaksi  dihentikan   dengan  menambahkan    0,6 mL
10%   asam   trikhloroasetat     (TCA).    Selanjutnya disentrifugasi   dengan  kecepatan   8000 rpm  selama
5 menit  dan filtrat dipisahkan  dari endapan. Pembacaan   Optical  density  (OD)  terhadap  tirosin yang dibebaskan  dalam filtrat dilakukan  dengan spektrofotometer   pada  A  280 nm.  Cara kerja  yang sama  dilakukan   untuk  larutan  standar  tirosin  dan blanko berupa air suling. Pada blanko, enzim ditambahkan  setelah direaksikan  dengan TCA. Satu unit aktivitas enzim protease didefinisikan sebagai banyaknya   enzim  yang  dapat  menghasilkan    1 ug tirosin  dalam kondisi  pengukuran   tersebut. 6

Aktivitas   protease   diuji  dengan   mengukur kadar asam amino sebagai produk hidrolisis  protein dari susu skim oleh enzim protease.  Larutan  enzim yang menghasilkan   asam amino yang terlalu tinggi diencerkan  terlebih  dahulu  dan faktor pengenceran digunakan  dalam perhitungan   aktivitasnya.

b. Karakterisasi   suhu, pH dan stabilitasnya

Pengaruh   pH  dan  suhu  terhadap   aktivitas enzim    diuji   dengan    cara   mereaksikan     larutan enzim  dengan  variasi  pH  substrat   azokasein   7,5-
11 dan  variasi  suhu  30-70°C.  Untuk  uji  stabilitas
enzim  terhadap   pH  dan  suhu,  sampel  diinkubasi

pada pH dan suhu masing-masing   selama  10 menit. Selanjutnya  dianalisis  seperti yang telah dijelaskan sebelumnya.


Hasil
Pada  Gambar  1 dapat  dilihat  aktivitas kualitatif  protease  dari B. licheniformis  pada media seleksi  agar yang  mengandung   substrat  susu skim diperlihatkan  dengan adanya zona bening  di sekitar koloni  bakteri.
Pada   Gambar   2  dapat   dilihat   aktivitas   B.
licheniformis   dengan waktu  inkubasi  1-6 hari.

Aktivitasnya    dari  66,79-150,52   U/mL,  pada  hari ke  2  didapat   aktivitas   protease   tertinggi   sebesar
150,52 U/mL.  Pada  hari ke 3-6 terjadi  penurunan
aktivitas,  terutama  pada  hari  ke  4 walaupun   pada hari ke 5 terjadi  kenaikan  lagi.
Pada  Gambar  3 dapat  dilihat pengaruh  suhu terhadap   aktivitas  protease.  Aktivitas   variasi   dari
51,73-   123,35  U/mL.   Pada   suhu  inkubasi   30°C
sampai   dengan   50°C  terjadi  kenaikkan   aktivitas, tetapi  pada  suhu 60°C dan 70°C terjadi  penurunan aktivitas.     Pada    suhu    50°C    didapat     aktivitas protease   tertinggi   sebesar   123,34    U/mL  dengan
stabilitasnya   sebesar  93,14 U/mL.

























Gambar    1. Zona  Bening  di sekitar   Koloni  B. licheniformis




~      160   I
<-,       140
2, 120
<l)
8
 
~     100       I- E   80
0..      60
~       40
.i::::
~        20
<r::          0


Ir- 1          -







r-e-


I  I
 
-
r-

.

2                3               4                5               6

In11kubasi   (hari)



Gambar   2. Aktivitas   Protease   Bakteri    B. licheniformis dalam  Waktu
Inkubasi    1-6 hari


~
140                                          100 ~

80
 
e- 120
~
"-'
el)

el)       100                                               eror:

eror:                                                                                                                         60

..e..l..)

..e..l..)        80
;...,            60                                          40   c,
:E
 
c,                                                                                             er:
eror:       40         _Aktivitas
.i::::                                                    -+- Stabilitas                      20
..6    20                                                      ~
~
 
~       0                                          0   ir:
30    35    40    50    60    70

Variasi  suuhu  (ac)




Gambar  3. Pengaruh  suhu terhadap  aktivitas  dan stabilitas  protease





250
90

80
200
70

 
-r-.

2,

el)
tr:


-r-.
~
"-'
60
 
el)
trro:

ro    150
E

..e..l..)
50  8

;c...,,


100

40  c,
tr:

tr:                                                             -+- Stabilitas

30  ro

.~    50

.i::::
20 .•....•

.~                                                                    10 ~..•....•

~
~       0                                         0
7.5   8    8.5    9    10    11

Variasi  pH

tr:





Gambar  4. Pengaruh  pH terhadap  Aktivitas  Protease  dan Stabilitas


Pada  Gambar  4 dapat  dilihat  pengaruh   pH terhadap   aktivitas  protease,   pada  inkubasi   2  hari dan  suhu  inkubasi  50°C didapat  aktivitas  berkisar antara  98,3-  193,14 U/mL.  Sedangkan  untuk stabilitas   enzim  dengan  waktu  inkubasi   10 menit berkisar   54,31-   83,11  U/mL.   Aktivitas   tertinggi didapat  pada  pH  10 sebesar   193,14 U/mL,  terjadi penurunan aktivitas setelah enzimnya diinkubasi didalam   larutan   bufer   selama   10  menit   sebesar
71,88 %.


Pembahasan

Hasil pengujian  secara kualitatif  ditunjukkan dengan    adanya   zona   bening    di   sekitar   koloni

mikroba. Hasil pengujian  secara kualitatif adalah dengan  adanya  lingkaran   bening  di sekitar  koloni dan  pengujian   secara   semikualitatif    adalah   hasil bagi   diameter   lingkaran   jernih   dengan   diameter koloni   dan  dinyatakan   sebagai   aktivitas  protease secara relatif. 7
Isolasi    dilakukan     dengan    menggunakan medium   yang   mengandung    azo   kasein,   karena azo  kasein   merupakan    substrat   yang  baik  untuk mengisolasi   bakteri  penghasil   enzim  protease   dan menginduksi   sintesis  enzim protease  alkalin. 8,9


 
Produksi   protease   dipengaruhi   oleh  waktu, suhu,   pH   inkubasi.    Dengan   waktu   inkubasi    2 hari didapat  aktivitas  protease  tertinggi.  Hasil penelitian  dengan waktu  inkubasi  optimum  selama
48 jam  pada   suhu  60°C  dan pH  11.10    Dilihat  dari kisaran    suhu   pertumbuhan,     B.licheniformis     ini dapat digolongkan  sebagai bakteri termofil.  Bakteri termofil  berkisar  antara 45-65°C. 11 Aktivitas  enzim juga   akan  meningkat   dengan  meningkatnya    suhu sampai  mencapai  suhu optimumnya,   tetapi  setelah melewati   suhu  optimumnya   aktivitas  enzim  akan menurun."    Kondisi   fermentasi   merupakan   faktor penting    untuk   menghasilkan     enzim.      Bacillus sp.   yang   ditumbuhkan    pada   lingkungan    alkali menghasil-kan      enzim    proteolitik     yang    alkali lebih   tinggi   dibandingkan    bila   bakteri   tersebut ditumbuhkan    pada   lingkungan   netral. 13     Protease dari B.licheniformis   mempunyai  pH optimum untuk aktivitasnya  antara 8 sampai 9. Stabil pada selang pH yang luas dan dapat diinaktifkan  dengan cepat pada pH di bawah  5 dan di atas 11.8 B. licheniformis  KA-
08 sangat potensi  menghasilkan   enzim termostabil. B. licheniformis   merupakan   mikroorganisme   yang sangat potensial  digunakan  sebagai  sumber  enzim, karena  bersifat  termofilik   yang  dapat  hidup  pada suhu   tinggi   50-65   °C.14     Untuk   B.  licheniformis N-2  menghasilkan   maksimum   proteolitik   sebesar
123,29  PU/ml   optimumnya   pada  suhu  60°C  dan pH     11.10        Berdasarkan      suhu    pertumbuhannya mikroba    digolongkan    menjadi    lima   kelompok yaitu    psikrofil     tumbuh     pada    suhu    -5-20°C, mesofil  suhu  20-45°C,  termofil  45-65°C,  termofil ekstrim   65-85°C    dan   hipertermofil    85-l00°CY Menurunnya     aktivitas    mengikuti    meningkatnya suhu  di  atas  optimum   biasanya   disebabkan   oleh perusakan   enzim."   Kecepatan   reaksi  kimia  akan meningkat  dengan meningkatnya   suhu karena  akan mempercepat   gerak termal  molekul  dan karenanya akan meningkatkan   bagian  molekul  yang memiliki energi  dalam jumlah  yang  cukup  untuk  memasuki keadaan      transisi.      Stabilitas      enzim     protease ditunjukkan    dengan   tidak   terjadinya    penurunan aktivitas    setelah    enzim    diinkubasi    selama    10 menit. 16  Pada suhu 70-80°C enzim akan mengalami kerusakan  yang mengakibatkan   hilangnya  aktivitas enzim.  Batasan  ini tidak mutlak,  karena  ada enzim tertentu  yang tahan terhadap  pemanasan  pada  suhu tinggi  yaitu  enzim  termostabil   dan ada juga  enzim yang   optimum   pada   suhu  rendah.   Enzim-enzim termostabil   mempunyai   karakteristik    biokimiawi yang menarik.  Sifat termostabilitas   enzim berkaitan

dengan   bagian   asam-asam    amino   yang   bersifat hidrofobik , intensitas   interaksi   elektrostatik    dan jembatan   disulfida  di antara  asam amino penyusun struktur  protein. 12
Aplikasi     enzim    pada    beberapa     industri menghendaki          enzim-enzim         yang        dalam beraktivitas    tahan   terhadap   panas   (termostabil). Hal    ini    berkaitan     dengan    keuntungan     yang akan   diperoleh    bila   proses   produksi    dilakukan pada    suhu    tinggi     dapat    menurunkan     resiko kontaminasi,      meningkatkan      kecepatan      reaksi sehingga   menghemat    waktu,   tenaga   dan  biaya, serta   menurunkan    viskositas    larutan   fermentasi sehingga   memudahkan   proses  produksi."    Dalam industri    fermentasi    protease    alkalin   merupakan jenis   protease   yang  paling   banyak   diaplikasikan dalam  bidang   industri. 1  Adanya   mikroorganisme yang  unggul  merupakan   salah  satu  faktor  penting dalam   usaha   produksi    enzim.   Oleh   karena   itu, penggalian    mikroorganisme     penghasil    protease perlu   dilakukan   di  Indonesia.   Keragaman   hayati yang tinggi  memberikan   peluang  yang besar untuk mendapatkan      mikroorganisme      yang    potensial untuk    dikembangkan     sebagai    penghasil    enzim protease.
Aktivitas     tertinggi     enzim    protease     dari Bacillus    licheniformis    pada   penelitian    ini  pada pH   10  dan  pada   suhu   50°C  dapat   digolongkan sebagai    enzim    yang    mempunyai     kemampuan bertahan  pada  lingkungan   alkalin  (tahan  terhadap basa)   dan  termofil   (tahan  terhadap   suhu  tinggi) sehingga     dapat    digunakan     untuk    biodeterjen. Enzim    alkalin    dan   termofil    merupakan    unsur penting  dalam  biodeterjen,   Protease  memiliki   pH optimum  antara  9 dan  10, apabila  ditambahkan   ke dalam  biodeterjen    dapat  menghilangkan    kotoran dari   protein. 18      B.   licheniformis     adalah   bakteri berbentuk  batang  gram-positif.   Banyak  digunakan untuk  keperluan   industri   seperti  produksi   enzim, antibiotik   dan metabolit  kecil.  Suhu pertumbuhan optimalnya  adalah 50°C, tetapi dapat juga bertahan pada  suhu  yang  lebih  tinggi.  Suhu  optimal  untuk sekresi   enzim   adalah   37°C.   Bakteri   ini   dapat bertahan   hidup  di lingkungan   yang  keras  dengan mengubahnya     berbentuk     spora    tetapi    apabila kondisi  baik,  ia  akan  kembali   ke  dalam  keadaan vegetatif. 19
B.    licheniformis     adalah    mikroorganisme tanah  membentuk   spora  yang  memberikan kontribusi     untuk    siklus    nutrisi    dan   memiliki


 
aktivitas  anti jamur.  Ada penelitian  terkini  tentang B.  licheniformis   (strain  SB3086)  dan efek  sebagai fungisida     mikroba.     Novozymes      Biofungicide Green Releafberisi   B. licheniformis   strain  SB3086 sebagai    bahan    utama    aktif    fungisida.     Dapat digunakan     pada    lapangan     rumput,     tumbuhan runjung,  bibit pohon, rumput  hias dan tanaman  hias di luar ruangan,  rumah kaca, dan situs pembibitan." Laju   reaksi   enzim   meningkat    pada   pH   alkalin kemudian   berkurang   setelah  pada  pH  maksimum telah  tercapai.   Dapat  dibandingkan   dengan  isolat Bacillus  macerans  PL3 dalam media  dedak sebesar
113,52  .10-2 U/mU   sedangkan   setelah  pemurnian
isolat     Bacillus      sp.     menghasilkan       aktivitas spesifiknya    43,02   U/mg    (kromatografi    penukar ion DEAE  Sephadex  A 50),21 isolat Aktinomisetes BYL-15  dan BYL-28  yang menunjukkan   aktivitas enzim   tertinggi,    masing-masing     106,450   U/mL dan  100,00  U/mL  filtrat  biakan   1, dan  dari  isolat Bacillus   sp. DA  5.2.3  dan  L5 masing-masing    2,0
U/mL  dan  1,4 U/mL.22


Kesimpulan
Kemampuan      produksi      enzim     protease dari bakteri Bacillus  licheniformis  memiliki kemampuan,   dimana  dengan waktu  2 hari inkubasi memiliki   aktivitas  tertinggi  sebesar  150,52 U/mL, pada  pH  10 sebesar   193,14  U/mL  dan  pada  suhu
50°C sebesar  123,34  U/mL.


Ucapan  Terima Kasih
Terima  kasih  kami  ucapkan  kepada  DIKTI-
LIPI 2009 yang telah mendanai  penelitian  ini.


Daftar   Pustaka
1.      Akhdiya     A.     Isolasi     Bakteri     Penghasil Enzim Protease Alkalin Termostabil Buletin Plasma  Nutfah,   2003,  9 (2): 38-44.
2.      Ahira  A   Protease   adalah  pemecah   protein. www.anneahira.com/enzim-adalah     .• diakses
4 Mei 2011.
3.      Moon,    S.H.    and    S.J.    Parulekar.     Same observation on    protease     producing     in continuous   suspention    cultures   of Bacillus firmus.  Biotech.  Bioeng,   1993,41  :43-54.
4.      Priest,  EG.  Extracellular   Enzymes   Sintesis in the  Genus  Bacillus.   Bacteriological   Rev.
, 1977,41(3).

5.        Cappuccino       J.G.,      and     N.      Sherman.
Mikrobiology   : A Laboratory   Manual. Addison- Wesley Publishing  Company. California  USA,    1983.
6.              Yang S.S., C.I. Huang.  Proteases  production by          amylolytic      fungi     in     solid      state fermentation.   Journal   Chinese  Agri   Chem Soe.,   1994,32(6):   589-60l.
7.      Naiola,  E., N. Widhyastuti.   Isolasi,  Seleksi dan    Optimasi     Produksi     Protease     dari Beberapa         Isolat    Bakteri.    Jurnal    Berita Biologi,  2002,  6(3): 467- 473.
8.        Ward,   O.P.   Proteinase.    Di   dalam   W.M.
Fogarty (ed). Microbial  and Enzyme Biotechnology.   Applied   Science  Publisher, New York,  1983.
9.         Fujiwara,   N.  and  Yamamoto,   K.  Di  dalam Akhdiya A Isolasi Bakteri Penghasil Enzim Protease Alkalin  Termostabil  Buletin  Plasma Nutfah,  2003,  9 (2): 38-44.
10.       Nadeem,   M.,  J.I.  Qazi,  S. Baig,  Q.  Syed.
Studies  on Commercially   Important  Alkline
Protease   from  Bacillus    licheniformis    N-2
Isolated  from  Decaying   Organic  Soil. Turk
Journal  Biochemistry,   2007,  32(4): 171-177.

11.     Rudiger,  A,  A   Sunna,  and  G. Antranikian.
Enzymes   from  Extreme   Thermophilic    and Hyperthermophilic     Archea    and   Bacteria. Di    dalam:     Carbohydrases,    Handbook   of Enzyme    Catalysis    in   Organic    Synthesis. VCH Verlagsgesellschafft,   Weinhem,  1994.
12.      Suhartono,    M.T.   Di   dalam    Rahayu,    S.
Karakteristik  Biokimiawi  Enzim Termostabil Penghidrolisis  Kitin. Makalah Pengantar Falsafah Sains (PPS 702). Sekolah Pasca Sarjana,  Institut  Pertanian  Bogor,  2004.
13.                           Glazer,   AN.    and   H.   Nikaida.    Di   dalam AgustienAdan           Y. Rilda. Produksi  Keratinase Termostabil  dari Bacillus   licheniformis  KA-
08  Amobil   dan  Aplikasinya    Untuk   Bahan
Penyamak   Kulit.   Artikel   Hibah   Bersaing,
2009.  repository.un  and.ac.id  I. ..IARTIKEL- HIBER   - ANTHONI     - A GUSTIN-2009
diakses  11 Agustus  2011.
14.     AgustierrA, danY. Rilda. Produksi Keratinase
Termostabil  dari Bacillus   licheniformis  KA-
08  Amobil   dan  Aplikasinya    Untuk   Bahan
Penyamak   Kulit.   Artikel   Hibah   Bersaing,


2009.    repository.unand.ac.idl...IARTIKEL-

19.     Veith, B., Herzberg,  c., Steckel,  S., Feesche,

HIBER - ANTHONI -
diakses  11 Agustus  2011.

A GUSTIN-2009

J.,  Maurer,  K.  H.,  Ehrenreich,   P., Baumer,
S.,  Henne,   A.,  Liesegang,   H.,  Merkl,   R.,


15.     VolkWA&MF.Wheeler.    Mikrobiologi  Dasar.
Jilid  1. Soenartono  Adisoemarto   Editor. Penerbit Erlangga Jakarta. Terjemahan dari: Basic  Microbiology,   fifth edition,  1988.
16.    Palmer,   T.  Extraction    and  purification    of enzymes.   In Understanding    Enzymes.   Ellis Horwoood  Ltd. England,   1991.
17.    Rahayu,  S. Karakteristik   Biokimiawi   Enzim Termostabil Penghidrolisis  Kitin. Makalah Pengantar                  Falsafah     Sains     (PPS     702). Sekolah   Pasca   Sarjana,   Institut   Pertanian Bogor,  2004.
18.    Snoke,   John   E.  (University    of  California, Los Angeles),   and Neal  Cornell.  Protoplast lysis and inhibition  of growth  of Bacillus licheniformis          by   bacitracin.    J  Bacteriol.
1965, 89:4l5-240.,jombangan.com/tautan/
bacillus-licheniformis.       Diakses     10    Mei
2011.

Ehrenreich,  A,  Gottschalk,  G. The complete genome  sequence   of Bacillus   licheniformis DSM13,  an organism with great industrial potential.    J  Mol.   Microbiol.    Biotechnol.
2004,7(4):204-2l1.jombangan.com/tautan/
bacillus-licheniformis    diakses  10 Mei 2011.
20.    Wikipedia.     Bacillus _licheniformis      http:// www.epa.gov/pesticides/biopesticides/          ingredients/tech                          _ docs/brad_   006492.pdf, diakses  10 Mei 2011.
21.    Naiola,  E., N. Widhyastuti.   Semi  Purifikasi dan  Karakterisasi   Enzim  Protease  Bacillus sp. Jurnal  Berkala  Penelitian  Hayati,  2007,
13(1): 51-56.
22.    Jamilah    I,   A    Meryandini,     I.   Rusmana, ASuwanto,    N.R.   Mubarik.    Activity    of Proteolilytic   and Amylolytic   Enzymes  from Bacillus   spp.  Isolated   from  Shrimp  Ponds. Microbiology   Indonesia,  2009,  3(2): 67-71.


 





































Media  Litbang  Kesehatan   Volume 21 Nomor  2 Tahun 2011                                                                                                         95
Poskan Komentar